4-丁基多羥基二苯甲酮衍生物YX2通過SIRT1/PGC1α促進NAFLD線粒體生物發(fā)生
第一部分：雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)初篩發(fā)現(xiàn)36個4-丁基多羥基二苯甲酮衍生物中有6個衍生物具有PGC1α轉(zhuǎn)錄激活活性，分別為：DL2、DX2、S4、YD、YM、YX2。以細胞存活率、脂質(zhì)蓄積和肝酶水平為指標復(fù)篩發(fā)現(xiàn)，6個衍生物中YX2對HepG2細胞（PA誘導(dǎo)損傷）的保護活性最好，EC50值為1.02 × 10-2± 1.56 × 10-3μmol/L，且YX2顯著改善細胞脂質(zhì)蓄積和肝功能異常。因此，我們選擇了YX2作為候選衍生物進行后續(xù)研究。
圖1 36個4-丁基多羥基二苯甲酮衍生物對PGC1α啟動子的影響
（與Control組相比，###P<0.001；與模型組相比，*P<0.05，***P<0.001）。Ctrl:培養(yǎng)液
Figure 1 Effects of thirty-six 4-butyl-polyhydroxy-benzophenone derivatives on PGC1α promoter activity. Compared with that in the control group,###P < 0.001; compared with that in the model group,*P< 0.05 and***P< 0.001. Ctrl, control
第二部分：與模型組相比，YX2組（1、5、25 μmol/L）細胞的TG、TC、ALT、AST、LDH活性顯著下降（P< 0.05，P< 0.01或P< 0.001），表明YX2可改善HepG2細胞（PA誘導(dǎo)）脂質(zhì)蓄積和肝酶增高。將模型組和YX2組（25 μmol/L）細胞的差異蛋白進行富集分析，發(fā)現(xiàn)YX2引起NAFLD通路和氧化磷酸化通路顯著變化（P <0.05），亞細胞定位發(fā)現(xiàn)差異蛋白主要分布在線粒體，蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果提示，YX2的治療作用可能與線粒體修復(fù)和生物發(fā)生高度相關(guān)。三個劑量的YX2組細胞GSH水平顯著增高，Mito SOX Red熒光強度顯著下降（P <0.01或P <0.001），且呈劑量依賴性，表明YX2可減輕細胞氧化應(yīng)激。YX2組（25 μmol/L）細胞線粒體形態(tài)損傷顯著緩解且ATP水平、氧耗率、JC-1紅色/綠色熒光比值、MFN1和OPA1的mRNA和蛋白表達水平顯著升高（P< 0.05，P< 0.01或P< 0.001），DRP1的mRNA和蛋白表達水平顯著下降（P< 0.05或P< 0.001），表明YX2可修復(fù)線粒體功能損傷。YX2組（25 μmol/L）細胞Mito-Tracker熒光強度、mtDNA拷貝數(shù)、ND6的mRNA和蛋白表達水平顯著升高（P< 0.05，P< 0.01或P< 0.001），表明YX2可緩解線粒體生物發(fā)生障礙。
圖2模型組和YX2組（25 μmol/L）差異蛋白質(zhì)的富集分析結(jié)果：
A. KEGG功能富集；B. GO Cellular Component富集
Figure 2 Enrichment analysis of differentially expressed proteins between the model and25 μmol/LYX2-treated HepG2 cells. A. KEGG functional enrichment. B. GO Cellular Component enrichment.
圖3 YX2緩解脂質(zhì)損傷的HepG2細胞線粒體生物發(fā)生障礙：A. mtDNA拷貝數(shù)；B. ND6的mRNA表達；C. ND6的蛋白表達（與Control組相比，##P<0.01，###P<0.001；與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001）
Figure 3 Compound YX2 ameliorated dysregulated mitochondrial biogenesis in lipid-damaged HepG2 cells. A. mtDNA copy number. B. ND6 mRNA level. C. ND6 protein level. Compared with that in the control group,##P<0.01 and###P<0.001; compared with that in themodel group,*P<0.05,**P<0.01 and***P<0.001
第三部分：與模型組相比，YX2組（25 μmol/L）細胞的SIRT1、PGC1α、NRF1、TFAM的mRNA和蛋白表達水平顯著升高（P< 0.05，P< 0.01或P< 0.001），表明YX2可上調(diào)HepG2細胞（PA誘導(dǎo)）SIRT1/PGC1α信號通路。與YX2組（25 μmol/L）相比，SIRT1敲降組細胞存活率顯著下降（P< 0.01），TG、TC、ALT、AST、LDH水平顯著升高（P< 0.001），SIRT1過表達組細胞存活率顯著升高（P< 0.05），TG、TC、ALT、AST、LDH水平顯著下降（P< 0.05，P< 0.01或P< 0.001），表明YX2通過SIRT1改善HepG2細胞存活率、脂質(zhì)蓄積和肝酶增高。SIRT1敲降組細胞GSH水平顯著下降（P< 0.001），SIRT1過表達組GSH水平顯著升高（P< 0.001），表明YX2通過SIRT1阻止HepG2細胞內(nèi)谷胱甘肽降低。SIRT1敲降組細胞氧耗率、ATP水平、MFN1和OPA1的mRNA和蛋白表達水平顯著下降（P< 0.05，P< 0.01或P< 0.001），DRP1的mRNA和蛋白表達水平顯著升高（P< 0.01或P< 0.001），SIRT1過表達組細胞ATP水平、MFN1和OPA1的mRNA和蛋白表達水平顯著升高（P< 0.05或P< 0.001），表明YX2修復(fù)線粒體功能障礙依賴于SIRT1。SIRT1敲降組細胞ND6的mRNA和蛋白表達水平顯著下降（P< 0.05或P< 0.001），SIRT1過表達組細胞ND6的mRNA和蛋白表達水平顯著升高（P< 0.05或P< 0.001），表明YX2靶向通過SIRT1緩解線粒體生物發(fā)生障礙。SIRT1敲降組細胞SIRT1、PGC1α、NRF1、TFAM的mRNA和蛋白表達水平顯著下降（P< 0.05，P< 0.01或P< 0.001），SIRT1過表達組細胞SIRT1、PGC1α、TFAM的mRNA和蛋白表達水平顯著升高（P< 0.05或P< 0.001），表明YX2靶向通過SIRT1上調(diào)SIRT1/PGC1α信號通路。SYBYL軟件模擬YX2與SIRT1結(jié)合Total Score為7.72，形成3個氫鍵，表明二者結(jié)合作用強；YX2可以提高HepG2細胞內(nèi)源性SIRT1蛋白的熱穩(wěn)定性，表明二者直接結(jié)合；YX2與SIRT1的解離平衡常數(shù)KD達712 μmol/L，表明二者有特異性結(jié)合；YX2與SIRT1之間以1:1的摩爾比結(jié)合，結(jié)合常數(shù)KA為25322 L/mol，二者作用屬于靜態(tài)猝滅，氫鍵和范德華力主導(dǎo)了二者的直接結(jié)合，且結(jié)合位點更接近色氨酸殘基，結(jié)果共同表明YX2促進NAFLD線粒體生物發(fā)生作用的靶點是SIRT1。進一步染色質(zhì)免疫沉淀實驗表明SIRT1可與PGC1α啟動子結(jié)合，且YX2可顯著上調(diào)此種結(jié)合（P< 0.001）。
圖4 YX2上調(diào)HepG2損傷細胞的SIRT1/PGC1α信號通路關(guān)鍵基因的mRNA表達：
A. SIRT1；B. PGC1α；C. NRF1；D. TFAM（與Control組相比，###P<0.001；與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001）
Figure 4 Compound YX2 upregulated the SIRT1/PGC1α pathway in lipid-damaged HepG2 cells. A. SIRT1 mRNA level. B. PGC1α mRNA level. C. NRF1 mRNA level. D. TFAM mRNA level. Compared with that in the control group,###P<0.001; compared with that in themodel group,*P<0.05,**P<0.01 and***P<0.001
圖5 YX2促進SIRT1與PGC1α啟動子的結(jié)合
（與Control組相比，###P<0.001；與模型組相比，**P<0.01）
Figure 5 Compound YX2incresed interaction ofSIRT1withPGC1α promoter. Compared with that in the control group,###P <0.001; compared with that in themodel group,***P<0.001
第四部分：與模型組相比，YX2組（25 mg/kg）小鼠體重和肝臟系數(shù)顯著下降（P< 0.05或P< 0.001），肝臟病理損傷明顯緩解，血清TG、TC、LDL、ALT、AST水平顯著下降，HDL水平顯著升高，肝臟TG、TC、ALT、AST、LDH水平顯著下降（P< 0.05，P< 0.01或P< 0.001），表明YX2可改善NAFLD小鼠的血脂紊亂和肝臟脂質(zhì)蓄積。YX2組（25 mg/kg）小鼠肝臟上調(diào)倍數(shù)最大和最小的差異代謝物均與能量代謝相關(guān)，差異代謝物富集分析發(fā)現(xiàn)YX2引起氧化磷酸化通路變化顯著（P< 0.05），與細胞蛋白組學(xué)的實驗結(jié)果一致，提示YX2的作用與線粒體高度相關(guān)；YX2組（25 mg/kg）小鼠肝臟下調(diào)最顯著的差異脂質(zhì)為TG (14:0/19:0/20:4)，毒性脂質(zhì)二酰基甘油、游離膽固醇、飽和脂肪酸、神經(jīng)酰胺、溶血磷脂酰膽堿顯著下調(diào)（P< 0.05）；脂質(zhì)組學(xué)實驗結(jié)果進一步提示，YX2可減輕NAFLD小鼠肝臟脂毒性。YX2組（12.6、25 mg/kg）小鼠血清GSH水平顯著升高（P< 0.05或P< 0.001），表明YX2可改善NAFLD小鼠機體的抗氧化系統(tǒng)。YX2組（25 mg/kg）小鼠肝臟ATP水平、MFN1和OPA1的mRNA和蛋白表達水平顯著升高（P< 0.05或P< 0.001），DRP1的mRNA和蛋白表達水平顯著下降（P< 0.05或P< 0.001），表明YX2可修復(fù)線粒體功能障礙。YX2組（25 mg/kg）小鼠肝臟mtDNA拷貝數(shù)、ND6的mRNA和蛋白表達水平顯著升高（P< 0.05），表明YX2可緩解線粒體生物發(fā)生障礙。YX2組（25 mg/kg）小鼠肝臟SIRT1、PGC1α、TFAM蛋白表達水平顯著升高（P< 0.05或P< 0.01），表明YX2可上調(diào)肝臟SIRT1/PGC1α信號通路。與YX2組（25 mg/kg）相比，抑制劑組小鼠（EX527，5 mg/kg）肝臟系數(shù)、血清TG、AST水平顯著升高（P< 0.05或P< 0.01），HDL水平顯著下降（P< 0.05），肝臟AST、LDH活性顯著升高（P< 0.05或P< 0.01），表明YX2緩解NAFLD小鼠作用呈SIRT1依賴性。抑制劑組小鼠肝臟mtDNA拷貝數(shù)顯著下降（P< 0.05），表明YX2可能通過SIRT1緩解線粒體生物發(fā)生障礙。
圖6 模型組和YX2組（25 mg/kg）小鼠肝臟代謝組學(xué)結(jié)果A.代謝物火山圖；
B.注釋到大于10個差異代謝物的HMDB分類圖；C. KEGG功能富集結(jié)果
Figure 6 The analysis of differentially expressed metabolites between the25 mg/kg
YX2-treated and the model group. A. Volcano plot of all identified metabolites. B. The top six HMDB classification. C. KEGG functional enrichment.
研究結(jié)果表明：4-丁基多羥基二苯甲酮衍生物YX2可靶向結(jié)合SIRT1，激活PGC1α轉(zhuǎn)錄，明顯緩解肝臟組織（肝細胞）的脂質(zhì)蓄積、肝酶異常，減輕氧化應(yīng)激，修復(fù)線粒體功能和生物發(fā)生障礙，激活SIRT1/PGC1α信號通路，為臨床防治NAFLD提供新的思路，具有重要的理論價值和臨床意義。
