c7c7.app二院張永紅團(tuán)隊(duì)揭示骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源囊泡中microRNA-335促進(jìn)骨折恢復(fù)作用機(jī)制研究
目前，骨組織修復(fù)及自愈的機(jī)制尚未得到完全的揭示，越來(lái)越多的研究轉(zhuǎn)向有促進(jìn)組織修復(fù)及再生能力的干細(xì)胞來(lái)源的囊泡中，其中囊泡中miRNA作為一種良好的生物標(biāo)志物在疾病進(jìn)展及疾病治療中發(fā)揮了巨大的作用，也引起了極大的關(guān)注，但是并沒(méi)有太多的基礎(chǔ)研究聚焦在外泌體促進(jìn)骨折恢復(fù)的機(jī)制研究上
2021年2月4號(hào)c7c7.app二院張永紅團(tuán)隊(duì)在雜志《Cell Death and Disease》上正式發(fā)表題目為“Role of microRNA-335 carried by bone marrow mesenchymal stem cells-derived extracellular vesicles in bone fracture recovery”的研究論文，闡述了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源囊泡中microRNA-335通過(guò)VapB和Wnt/β-catenin通路促進(jìn)骨折恢復(fù)作用機(jī)制。
第一部分：構(gòu)建小鼠骨折模型、培養(yǎng)骨髓間充干細(xì)胞（BMMSCs）分離及鑒定胞外囊泡（EVs）。1.研究使用C57BL/6小鼠以及實(shí)驗(yàn)室改造完成并正常繁育飼養(yǎng)的C57BL/6 CD9-/-遺傳型小鼠進(jìn)行構(gòu)建骨折模型；所用細(xì)胞為小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs）。2. 從培養(yǎng)4-6代的BMMSCs中提取B-EVs，通過(guò)透射電鏡、Western Blot以及納米粒徑分析儀鑒定E-BVs的形態(tài)、特異性蛋白（CD11b、CD 45、CD29以及CD90）的表達(dá)情況以及粒徑大。3. 野生型（wild type，WT)和CD9-/- C57BL/6小鼠中使用C形工具施加三點(diǎn)彎曲產(chǎn)生橫向股骨干骨折，在建模結(jié)束后的0、1、2、3、4周，對(duì)小鼠骨折模型骨愈合情況進(jìn)行分析，通過(guò)高分辨SKYSCAN進(jìn)行活體顯微影像學(xué)分析、計(jì)算機(jī)斷層掃描骨密度等進(jìn)行分析，驗(yàn)證小鼠骨折模型。
BM-MSCs細(xì)胞中提取EVs，通過(guò)納米粒徑分析、透射電鏡分析及Western Blot分析結(jié)果證明分離得到的B-EVs的正確性，可以用于后續(xù)研究；兩組小鼠在建模前即可檢測(cè)時(shí)，野生型小鼠的體重和骨密度無(wú)顯著差異，CD9-/-小鼠脛骨生長(zhǎng)板的寬度顯著減少，野生型小鼠在骨折后2周通過(guò)骨痂形成表現(xiàn)出軟骨內(nèi)骨化， 3周時(shí)骨愈合明顯，與野生型小鼠相比，CD9-/-小鼠表現(xiàn)出骨折愈合的顯著延遲。骨折后3周CD9-/-小鼠骨愈合率為25%，明顯低于野生型小鼠，表明與野生型小鼠相比，CD9-/-小鼠的愈合能力下降；
A：EVs分離純化的步驟；B：透射電鏡檢測(cè)EV的形態(tài)；C：NTA檢測(cè)EVs的大小及分布情況；E：western blot檢測(cè)EVs的特異性蛋白
兩組小鼠CD9-/-小鼠骨折愈合受損情況分析
（A） X射線檢測(cè)骨愈合率；（B）骨愈合率檢測(cè)兩組小鼠的骨愈合情況；
（C）骨折后2周和3周切取WT和CD9-/-小鼠股骨，用H&E染色；比例尺= 100 μm
第二部分：EVs干預(yù)下骨折小鼠模型中差異miRNA的鑒定。1.分組：對(duì)構(gòu)建的小鼠模型進(jìn)行分組，分別為WT + NC組（GW4869干預(yù)后，EV-NC注射的WT小鼠）、WT + EVs組（注射B-EVs的WT小鼠）、WT + EVs-Mock組（注射B-EVs的WT小鼠預(yù)先轉(zhuǎn)染miR-335抑制劑NC）、WT + EVs-Inhibitor組（WT小鼠注射B-EVs預(yù)先轉(zhuǎn)染miR-335 Inhibitor）；CD9-/-小鼠分別分為：CD9-/-+ NC組（CD9-/-小鼠注射GW4869干預(yù)后的EV-NC）、CD9-/-+ B-EVs組（CD9-/-小鼠注射B-EVs）、CD9-/-+ EVs-Mock組（CD9-/-小鼠注射B-EVs預(yù)先轉(zhuǎn)染miR-335 Inhibitor NC）、CD9-/-+ EVs-Inhibitor組（CD9-/-小鼠注射B-EVs前轉(zhuǎn)染miR-335抑制劑）。2.EVs的注射時(shí)間及劑量：各組小鼠均于骨折后第1天和第8天在骨折部位注射EVs 100 μL或外泌體抑制劑GW4869作用下的EV-NC 100 μL；3.使用pCDH質(zhì)粒通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染建立過(guò)表達(dá)miR-335-inhibtor和 EVs-Inhibitor的穩(wěn)定骨細(xì)胞系；4. 骨折建：2周切取WT小鼠和CD9-/-小鼠股骨，將組織在4%緩沖多聚甲醛中固定48 h，隨后用緩沖EDTA進(jìn)行脫鈣處理。5. 免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry，IHC）檢測(cè)骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（Bone morphogenetic protein 2，BMP2)；6. RT-qPCR檢測(cè)差異表達(dá)miRNA的表達(dá)水平；7. 放射免疫沉淀試驗(yàn)分析提取總蛋白；8. 微陣列檢測(cè)差異表達(dá)3只WT + PBS治療的小鼠和3只WT + B-EV治療的小鼠miRNA；9. 通過(guò)SPSS21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
本部分實(shí)驗(yàn)顯示：B-EV處理促進(jìn)了成骨細(xì)胞的分化和骨折的恢復(fù)；EVs對(duì)CD9-/-小鼠的治療作用明顯低于WT小鼠； 與WT小鼠相比，EV處理后的CD9-/-小鼠軟骨組織中73個(gè)miRNA下調(diào)，104個(gè)miRNA上調(diào)，挑選差異表達(dá)最顯著的miR-335、miR-136、miR-125a、miR-217、miR-487a、miR-339、miR-298和miR-133a進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)； EvimiRNA在線預(yù)測(cè)網(wǎng)站上分析miR-335的分布，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-335在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中含量豐富，我們推測(cè)miR-335可能在骨折的修復(fù)中發(fā)揮作用。外泌體抑制劑GW4869對(duì)B-EVs的分泌無(wú)明顯影響；5. HE染色、甲苯胺藍(lán)染色及BMP2免疫組化結(jié)果顯示B-EV中miR-335對(duì)小鼠骨折恢復(fù)具有促進(jìn)作用；
放射學(xué)及HE染色檢測(cè)EV治療后第0周、1周、2周、4周骨折小鼠的恢復(fù)情況
（A,B）骨折小鼠的X射線檢測(cè)結(jié)果，骨愈合評(píng)分；（C）骨折建：2周，切除小鼠股骨，進(jìn)行HE和苯胺藍(lán)染色以及免疫組化BMP2檢測(cè)。
從轉(zhuǎn)染miR-335抑制劑或其陰性對(duì)照Mock的培養(yǎng)了48 h BMSCs中提取EVs,并在骨折后第1天和第8天對(duì)WT和CD9-/-骨折小鼠進(jìn)行處理；
（A）EV治療后0、1、2和4周WT和CD9-/-骨折小鼠的代表性放射學(xué)圖像。（B）HE染色、甲苯胺藍(lán)染色、BMP2的免疫化學(xué)觀察EVs抑制劑治療WT和CD9-/-骨折小鼠股骨骨折愈合情況。（C）RT-qPCR和（D）western blot分析測(cè)定骨折后2周小鼠股骨α-SMA、OCN、GDF-10、FGF-2的mRNA和蛋白水平。
第三部分：microRNA-335通過(guò)囊泡相關(guān)膜蛋白（Vesicle associated membrane protein,VapB）和典型Wnt/β-catenin通路（Canonical Wnt/β-catenin pathway，Wnt/β-catenin）促進(jìn)骨折恢復(fù)。1.通過(guò)MTT檢測(cè)成骨細(xì)胞樣細(xì)胞MC3T3和MG63的活力、Tunel及Alizarin red檢測(cè)成骨細(xì)胞樣細(xì)胞MC3T3和MG63細(xì)胞凋亡。2. 堿性磷酸酶染色檢測(cè)培養(yǎng)的小鼠骨細(xì)胞，使用AP染色液進(jìn)行染色，使用光學(xué)顯微鏡對(duì)紅染細(xì)胞集落與無(wú)色集落進(jìn)行計(jì)數(shù)，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞；3. 依據(jù)Lipofectamine 2000的說(shuō)明書，將質(zhì)粒分別與mimic NC或mimic miR-335共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞。使用Dual-Glo®雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)驗(yàn)證miR-335和VapB之間的結(jié)合關(guān)系；4. RNA pull down檢測(cè)蛋白作用關(guān)系，使用識(shí)別RBP的一抗來(lái)檢測(cè)目標(biāo)RBP與適當(dāng)?shù)牡诙贵w一起孵育以識(shí)別第一抗體，并使用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光檢測(cè)信號(hào)；
本部分研究結(jié)果：1. MTT方法檢測(cè)了成骨細(xì)胞MC3T3和MG63細(xì)胞的增殖率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EVs的處理促進(jìn)了細(xì)胞增殖。TUNEL染色結(jié)果顯示，EV處理可抑制細(xì)胞凋亡；2. F-actin的免疫熒光染色觀察了MC3T3和MG63細(xì)胞的細(xì)胞粘附，發(fā)現(xiàn)B-EV處理對(duì)細(xì)胞粘附無(wú)明顯影響；3. 人I型膠原蛋白（Human type I collagen，ColⅠ）的免疫熒光染色證明B-EVs促進(jìn)ColⅠ表達(dá)，與茜素紅染色結(jié)果一致。RT-qPCR和western blot分析驗(yàn)證B-EV處理可增加α-SMA、OCN、GDF-10和FGF-2的水平；4. RT-qPCR顯示EVs-Inhibitor處理后miR-335表達(dá)明顯下降，并伴有細(xì)胞增殖率的下降和細(xì)胞凋亡的增加。而且，ALP、茜素紅和ColⅠ免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，B-EVs攜帶的miR-335的干預(yù)部分抵消了B-EVs對(duì)MC3T3和MG63細(xì)胞成骨細(xì)胞分化的促進(jìn)作用；5. 囊泡相關(guān)膜蛋白（Vesicle associated membrane protein,VapB）能促進(jìn)破骨細(xì)胞的生長(zhǎng)，因此我們重點(diǎn)研究了VapB，HEK293T細(xì)胞中的雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)顯示miR-335可以靶向VapB；6. RT-qPCR和western blot分析檢測(cè)小鼠和細(xì)胞中VapB水平。結(jié)果顯示，EV處理抑制了VapB水平，而miR-335抑制可以緩解VapB的抑制；7. miRwalk、TargetScan、EvimcrRNA和Starbase的網(wǎng)站上預(yù)測(cè)并篩選了miR-335的7個(gè)靶基因（SMARCA2、VAPB、NAA25、KLHL28、NUCKS1、RCC2和RBFOX2），通過(guò)文獻(xiàn)調(diào)研，我們發(fā)現(xiàn)囊泡相關(guān)膜蛋白（Vesicle associated membrane protein,VapB）能促進(jìn)破骨細(xì)胞的生長(zhǎng)。使用RT-PCR和western blot鑒定過(guò)表達(dá)VapB細(xì)胞的構(gòu)建情況，RT-qPCR顯示，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中VapB mRNA的表達(dá)明顯增加，使用western blot在蛋白中觀測(cè)到了相似結(jié)果；MTT檢測(cè)細(xì)胞活力及TUNEL染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡的結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)VapB細(xì)胞的細(xì)胞伴有細(xì)胞增殖率的下降和細(xì)胞凋亡的增加，表明VapB過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；VapB過(guò)表達(dá)部分抵消了B-EVs對(duì)MC3T3和MG63細(xì)胞成骨細(xì)胞分化的促進(jìn)作用。8. 過(guò)表達(dá)VapB可逆轉(zhuǎn)EVs對(duì)Wnt和β-catenin蛋白表達(dá)的促進(jìn)。提示EVs中靶向VapB的miR-335可能與Wnt和β-catenin通路有關(guān)。
從轉(zhuǎn)染miR-335抑制劑或Mock的培養(yǎng)了48h的BMSCs中提取EVs，并作用于MC3T3和MG63細(xì)胞24h
（A,B）：MTT法測(cè)定MC3T3和MG63細(xì)胞活力。（C）TUNEL染色測(cè)定MC3T3和MG63細(xì)胞凋亡。（D）采用ALP法測(cè)定MC3T3和MG63細(xì)胞ALP活性。（E）茜素紅染色驗(yàn)證MC3T3和MG63骨分化能力。（F）免疫熒光染色測(cè)定細(xì)胞ColⅠ的表達(dá)；（G、H）RT-qPCR和western blot檢測(cè)測(cè)定α-SMA、OCN、GDF-10、FGF-2的mRNA和蛋白水平。
miR-355靶向作用VapB
（A）RNA pull-down實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證MC3T3和MG63細(xì)胞中miR-335與VapB的結(jié)合。（B，C）通過(guò)RT-qPCR和western blot分析測(cè)定骨折小鼠模型或MC3T3和MG63細(xì)胞（D、E）中VapB mRNA和蛋白水平。
B-EVs攜帶的miR-335靶向VapB，通過(guò)激活Wnt/β-catenin通路促進(jìn)骨折恢復(fù)。（A，B）Western blot分析測(cè)定骨折小鼠股骨及MC3T3、MG63細(xì)胞Wnt/β-catenin相關(guān)蛋白水平。
