長(zhǎng)鏈非編碼RNA LOC103690121促進(jìn)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的1型糖尿病大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡

糖尿病引起的認(rèn)知功能障礙是嚴(yán)重的糖尿病并發(fā)癥，目前其發(fā)病機(jī)制還不完全清楚，可能與大腦中的胰島素抵抗和葡萄糖誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡有關(guān)。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（LncRNA）是近十余年的生命科學(xué)研究中研究最火的領(lǐng)域之一，承擔(dān)了各種調(diào)控功能。已有報(bào)道LncRNA EBF3-AS表達(dá)與阿爾茨海默。ˋD）患者的神經(jīng)細(xì)胞凋亡相關(guān)，而且最近lncRNA與糖尿病引起的認(rèn)知功能障礙之間關(guān)系的研究正在增加。然而，lncRNA相關(guān)的糖尿病引起的認(rèn)知障礙的機(jī)制仍然很不清楚，需要被發(fā)現(xiàn)。我們通過(guò)研究在海馬內(nèi)找出了一個(gè)與糖尿病大鼠認(rèn)知功能障礙相關(guān)的差異表達(dá)的lncRNAs（LOC103690121），并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行了初步的探討。

我們首先用鏈脲佐菌素成功誘導(dǎo)了1型糖尿病大鼠模型，8周后水迷宮實(shí)驗(yàn)證實(shí)糖尿病大鼠發(fā)生了認(rèn)知功能減退。

圖1糖尿病大鼠的血糖水平，體重和認(rèn)知功能A，實(shí)驗(yàn)期間糖尿病和對(duì)照大鼠的空腹血糖水平；B，體重曲線(xiàn)；C，為兩組大鼠定位航行試驗(yàn)中逃逸潛伏期的比較；D，為兩組大鼠空間探索試驗(yàn)中目標(biāo)象限逗留時(shí)間的比較。*，**和***分別與對(duì)照相比p <0.05，p <0.01和p <0.001。

HE和Nissl的染色顯示，與對(duì)照相比，糖尿病大鼠的海馬神經(jīng)元減少（圖2A和B）。TUNEL檢測(cè)顯示糖尿病大鼠TUNEL陽(yáng)性（綠色）凋亡神經(jīng)元的百分比高于對(duì)照（圖2C）。Western印跡分析顯示糖尿病海馬中caspase-3/8/9和Bax的表達(dá)顯著高于對(duì)照組（p <0.001）;糖尿病大鼠中Bcl-2的表達(dá)低于對(duì)照（p <0.001，圖2D）。這些數(shù)據(jù)顯示糖尿病與大鼠海馬神經(jīng)元凋亡增加有關(guān)。

圖2.海馬的組織病理學(xué)檢查A，HE染色的圖像（放大倍數(shù)×40）；B，尼氏染色結(jié)果（放大倍數(shù)×40）及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（計(jì)算放大倍數(shù)×400的每個(gè)視野的神經(jīng)元數(shù)）；C，TUNEL染色（放大倍數(shù)×200）結(jié)果的；D，Western blot分析海馬區(qū)凋亡相關(guān)蛋白。*，**和***分別與對(duì)照相比p <0.05，p <0.01和p <0.001。

為了研究糖尿病對(duì)lncRNA表達(dá)譜的影響，我們使用大鼠LncRNA芯片v2.0進(jìn)行高通量分析，一共在SD大鼠海馬內(nèi)檢測(cè)到13,611個(gè)lncRNA和24,626個(gè)mRNA。與對(duì)照相比，糖尿病大鼠海馬中有49種上調(diào)的和52種下調(diào)的lncRNA。

圖3.差異LncRNA火山圖圖中每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)基因，紅色代表上調(diào)基因（fold change>1.5倍，P<0.05），綠色代表下調(diào)基因（fold change>1.5倍，P<0.05），黑色為無(wú)差異表達(dá)基因。

在這些lncRNA中，與對(duì)照相比，LOC103690121（ASRNV20033251探針，外顯子重疊，相關(guān)基因：ENSRNOT00000011775Unc79）在糖尿病中上調(diào)2.3倍（p <0.001，圖4A）。為了證實(shí)LOC103690121與糖尿病的關(guān)聯(lián)，我們檢測(cè)了用高濃度葡萄糖（35mmol / l）處理的大鼠海馬神經(jīng)元（RN-h細(xì)胞）中的LOC103690121，結(jié)果顯示葡萄糖處理以時(shí)間依賴(lài)性方式增加LOC103690121的相對(duì)表達(dá)水平（圖4B），在葡萄糖刺激后24小時(shí)具有最高相對(duì)水平。這一事實(shí)表明LOC103690121的相對(duì)表達(dá)與神經(jīng)元中的葡萄糖水平相關(guān)。

圖4.高葡萄糖對(duì)LOC103690121表達(dá)的影響A，葡萄糖處理后10個(gè)顯著表達(dá)lncRNAs的相對(duì)表達(dá)水平。B，LOC103690121葡萄糖處理后的表達(dá)模式

為了研究LOC103690121表達(dá)與糖尿病大鼠海馬神經(jīng)元增殖的關(guān)聯(lián)，我們通過(guò)用針對(duì)LOC103690121的siRNA轉(zhuǎn)染RN-h神經(jīng)元細(xì)胞來(lái)抑制LOC103690121表達(dá)，并使用過(guò)表達(dá)質(zhì)粒增加LOC103690121表達(dá)（圖5A）。我們發(fā)現(xiàn)LOC103690121的過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)較低的細(xì)胞活力（p <0.05，圖5B），較低的EdU陽(yáng)性細(xì)胞百分比（p <0.001，圖5C和D），較高的凋亡神經(jīng)元百分比（p <0.001，圖5E）和葡萄糖處理相比，hoechst33342標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)量增加（圖5F）。相比之下，siRNA對(duì)LOC103690121表達(dá)的抑制逆轉(zhuǎn)了所有這些變化，顯示出更高的細(xì)胞活力（p <0.01），更高的EdU陽(yáng)性細(xì)胞百分比（p <0.001），更低的凋亡神經(jīng)元百分比（p <0.001），以及與葡萄糖處理相比，hoechst33342標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)量減少（圖5）。

圖5.LOC103690121促進(jìn)葡萄糖誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡A，LOC103690121相對(duì)表達(dá)水平，C和D細(xì)胞存活率分析，EdU陽(yáng)性細(xì)胞百分比，E，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，F(xiàn)，hoechst33342 / PI雙染（放大倍數(shù)×200）。**和***分別與對(duì)照相比p <0.01，p <0.001。###注意到與葡萄糖處理相比p <0.001。

蛋白質(zhì)印跡分析顯示LOC103690121的過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了葡萄糖誘導(dǎo)的凋亡相關(guān)蛋白的變化，包括促進(jìn)caspase-3/8/9和Bax的表達(dá)并抑制Bcl-2表達(dá)（圖6A），而siRNA轉(zhuǎn)染阻礙了這些變化。這些數(shù)據(jù)表明，LOC103690121的表達(dá)對(duì)葡萄糖誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡具有促進(jìn)作用。為了探討與葡萄糖和LOC103690121誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡相關(guān)的機(jī)制，我們檢測(cè)了PI3K / Akt信號(hào)在葡萄糖處理和lncRNA表達(dá)的響應(yīng)中的表達(dá)。圖6B顯示通過(guò)葡萄糖處理和LOC103690121表達(dá)抑制p-PI3K和p-Akt表達(dá)的表達(dá)。LOC103690121過(guò)表達(dá)增強(qiáng)葡萄糖誘導(dǎo)的PI3K / Akt信號(hào)傳導(dǎo)失活。然而，siRNA對(duì)LOC103690121的抑制顯著恢復(fù)了葡萄糖誘導(dǎo)的變化（p <0.01，圖6B）。這些結(jié)果表明，LOC103690121表達(dá)抑制PI3K / Akt信號(hào)的激活，這可能促進(jìn)葡萄糖誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡。

圖6.Western印跡分析.A，凋亡相關(guān)蛋白的倍數(shù)變化，B，PI3K / Akt途徑蛋白的倍數(shù)變化。*和***分別與對(duì)照相比p <0.05和p <0.001。相對(duì)于葡萄糖處理，＃，##和###注意到p <0.05，p <0.01和p <0.001。

總之，我們的研究證實(shí)，STZ誘導(dǎo)的糖尿病和認(rèn)知功能障礙與lncRNA表達(dá)譜譜的改變有關(guān)，包括上調(diào)的LOC103690121。高糖誘導(dǎo)LOC103690121表達(dá)，其表達(dá)與神經(jīng)元凋亡呈負(fù)相關(guān)。抑制LOC103690121逆轉(zhuǎn)葡萄糖誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。此外，我們發(fā)現(xiàn)LOC103690121介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡與PI3K / Akt信號(hào)通路有關(guān)。

該研究成果發(fā)表在《Neuroscience Letters》上，題為“A long noncoding RNA LOC103690121 promotes hippocampus neuronalapoptosis in streptozotocin-induced type 1 diabetes”。