骨髓間充質(zhì)干細胞通過抑制破骨相關(guān)因子和分化為軟骨細胞改善膠原誘導關(guān)節(jié)炎大鼠的骨侵蝕
類風濕性關(guān)節(jié)炎(RA)以對稱性多關(guān)節(jié)炎為特征，滑膜炎癥浸潤以及免疫細胞和滑膜成纖維細胞之間的相互作用最終導致軟骨和骨侵蝕。傳統(tǒng)的類風濕性關(guān)節(jié)炎藥物主要包括非甾體類抗炎藥和傳統(tǒng)改善病情抗風濕藥物，這些藥物通常會引起胃腸道副作用、腎損害、骨髓抑制和心理障礙。近年來對RA的研究進展已經(jīng)闡明了炎癥、自身免疫、細胞因子網(wǎng)絡和各種細胞功能在RA發(fā)生和發(fā)病中的作用。多種靶向抑制免疫細胞、細胞因子及其信號通路藥物的上市使許多難治性RA患者受益。然而，這類藥物僅針對RA發(fā)病的某一步驟，而且價格昂貴。可引起注射部位、腫瘤及肺結(jié)核等傳染病的反應，停藥后易復發(fā)。此外，大約30%的患者對這種治療沒有反應，臨床緩解的RA患者在影像學檢查時顯示進行性關(guān)節(jié)糜爛。因此，在RA的關(guān)節(jié)損傷后，關(guān)節(jié)糜爛不能通過藥物治療干預有效修復，是進行性關(guān)節(jié)損傷、繼發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)功能障礙的危險因素。細胞、組織和基因工程的進步使得干細胞治療適合于類風濕關(guān)節(jié)炎。間充質(zhì)干細胞(MSCs)具有多能性，易于分離和擴增，特別是分化為軟骨細胞，具有免疫調(diào)節(jié)和抗炎功能。因此，它們是修復RA患者關(guān)節(jié)損傷的理想治療方法。大量研究報道MSCs在RA中具有免疫調(diào)節(jié)作用;然而，沒有研究報道MSCs植入RA患者或RA動物模型的命運。外用MSCs后，MSCs遷移、歸巢到關(guān)節(jié)組織以及抑制大鼠骨破壞的機制尚不清楚。
因此，為明確骨髓MSCs(BMSCs)對RA動物經(jīng)典模型-CIA大鼠的干預作用，并分析其發(fā)揮作用的具體機制，c7c7.app第三臨床醫(yī)學院風濕免疫科張莉蕓教授團隊在大鼠體內(nèi)實驗中研究了BMSCs對CIA大鼠的干預效果，評估其關(guān)節(jié)炎指數(shù)、影像學及滑膜病理改變；通過尾靜脈給藥綠色熒光蛋白（GFP）標記的MSCs，追蹤MSCs的遷移和歸巢，并探討其抑制骨破壞的機制，為BMSCs在RA的臨床轉(zhuǎn)化應用提供重要的理論和實驗基礎。該研究成果于2020年以“Bone marrow mesenchymal stem cells improve bone erosion in collagen-induced arthritis by inhibiting osteoclasia-related factors and differentiating into chondrocytes”為題發(fā)表于Stem Cell Research & Therapy上。
該研究結(jié)果顯示：
1、大鼠BMSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定
在標準培養(yǎng)條件下，大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞粘附在塑料基質(zhì)上生長，呈現(xiàn)長紡錘狀形態(tài)(圖1A)。流式細胞術(shù)分析BMSCs表面抗原表型顯示CD44、CD105和CD29表達，而CD45、CD34和CD31不表達。此外，在誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，BMSCs在體外具有成脂、成骨和成軟骨分化的潛力(圖1C-F)。此外，熒光顯微鏡下，市售GFP標記的MSCs的形態(tài)與我們實驗室提取和培養(yǎng)的大鼠BMSCs相似，細胞顯示綠色熒光信號(圖1B)。
圖1：BMSCs與GFP-BMSCs的特性
2.BMSCs移植對CIA大鼠的干預作用評估
經(jīng)靜脈輸注BMSCs可改善CIA大鼠關(guān)節(jié)炎癥，延緩CIA大鼠關(guān)節(jié)炎放射學進展，作用與RA經(jīng)典藥物MTX相似。
圖2：BMSCs減輕了CIA大鼠的炎癥反應，并抑制其骨破壞
3.BMSCs對CIA大鼠血清及滑膜中趨化因子軸及骨代謝相關(guān)因子表達的影響：
BMSCs抑制血清CXCL10的表達(圖3A)，并抑制滑膜處CXCL10和CXCR3的表達（圖3B）。mRNA表達分析顯示（圖3C），BMSCs可能調(diào)節(jié)血清和滑膜組織中RANKL/OPG的表達水平。
圖3：BMSCs對CIA模型大鼠RANKL/OPG/TRAF6信號通路及CXCL10/CXCR3趨化因子軸的影響
4.CIA大鼠關(guān)節(jié)中GFP-MSCs遷移定植及軟骨細胞分化的研究
干預后第3、11、30和42天，在CIA模型大鼠后踝關(guān)節(jié)中追蹤GFP-BMSCs。移植3天后，GFP陽性細胞主要分布在骨髓和滑膜組織中(圖4A、B、C)，軟骨組織中未觀察到GFP陽性細胞(圖4D)。從第11天開始在軟骨中觀察到GFP陽性細胞，并逐漸從梭形細胞轉(zhuǎn)變?yōu)闄E圓形/球形細胞(圖4E)，移植后42 d仍觀察到GFP陽性細胞(圖4F)。抗Ⅱ型膠原免疫熒光染色觀察到關(guān)節(jié)軟骨(尤其是受損軟骨)中有抗Ⅱ型膠原/GFP雙陽性細胞（圖5）。
圖4:GFP-BMSCs移植后3 d在滑膜軟骨和骨髓中的分布
圖5：免疫熒光染色顯示BMSCs在軟骨損傷部位轉(zhuǎn)變?yōu)镚FP/ II型膠原雙陽性細胞(1000×)
綜上，BMSCs可通過抑制CXCL10/CXCR3趨化軸和調(diào)節(jié)RANKL/OPG比值，并直接分化為軟骨細胞，改善CIA大鼠的骨破壞，為BMSCs在RA治療的臨床轉(zhuǎn)化應用提供重要依據(jù)。
張莉蕓教授為本研究的通信作者，高晉芳為本研究論文的第一作者，該研究得到國家自然科學基金、山西省科技廳自然科學基金面上項目的支持。
