絲狀噬菌體是一類常見的細菌病毒，其長度約為1-2 μm，直徑約6-7 nm。絲狀噬菌體的衣殼包裹著一個環(huán)狀單鏈 DNA 基因組1。病毒粒子的長度取決于其所包裝基因組的大小和拷貝數(shù)2。絲狀噬菌體的衣殼由數(shù)千個衣殼蛋白 pVIII 和僅有幾個拷貝的四個次要衣殼蛋白(包括 pIII，pVI，pVII 和 pIX)組裝而成3。與有尾烈性噬菌體不同，絲狀噬菌體從宿主細胞釋放通過一個類似于毒性因子分泌的過程，而不是通過裂解宿主細胞。盡管不同絲狀噬菌體的結(jié)構(gòu)已經(jīng)被廣泛研究，但是由于其奇特的外形，絲狀噬菌體次要衣殼蛋白在病毒組裝中的作用以及絲狀噬菌體基因組包裝的分子機制知之甚少。
2023年9月5日，清華大學醫(yī)學院長聘副教授，北京生物結(jié)構(gòu)前沿研究中心研究員，c7c7.app-清華大學前沿醫(yī)學研究中心研究員向燁課題組在《自然-通訊》（Nature communications）雜志在線發(fā)表了題為"Cryo-EM structure of a bacteriophage M13 mini variant"（噬菌體 M13迷你變異體的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)）的研究論文，報道了噬菌體M13一個迷你粒子的衣殼及內(nèi)部ssDNA基因組結(jié)構(gòu)，該研究提供了絲狀噬菌體組裝的全新分子機制。
基于1992年Specthrie, L等人的實驗方法4，向燁團隊對M13的基因組進行改造，并通過輔助噬菌體的幫助，成功表達出長度約為50 nm的迷你M13噬菌體，并對其進行冷凍電鏡結(jié)構(gòu)研究（圖1）。在冷凍電鏡數(shù)據(jù)分析中，應(yīng)用block based reconstruction方法5，得到噬菌體的中間部分和兩個末端的高分辨密度圖，建立了完整衣殼的原子模型（圖1）。通過對完整衣殼結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)M13迷你噬菌體的末端由兩個帽狀復合物密封，這兩個復合物由pVII，pIX，pIII和pVI這四種次衣殼蛋白組成。頂部帽復合物由 pVII 和 pIX 的五聚體組成，兩者都具有單一的螺旋結(jié)構(gòu)。頂部帽復合物內(nèi)側(cè)帶電荷的殘基，包括pVII 的Arg33和 pIX 的 Glu29，在空間上靠近內(nèi)部基因組的包裝信號區(qū)域。進一步通過突變研究發(fā)現(xiàn)這兩個氨基酸殘基在病毒組裝中起著關(guān)鍵作用。M13迷你噬菌體中間部分與前人研究結(jié)果類似，是一個由pVIII組成的螺旋桶裝結(jié)構(gòu)。第一層pVIII的曲度相較于中間部分的分子更大，其在頂部帽狀結(jié)構(gòu)和中間螺旋部分中起到過渡作用。M13迷你噬菌體底部的帽狀結(jié)構(gòu)由具有鉤狀結(jié)構(gòu)的pIII 和 pVI形成。PIII和pVI分子通過氫鍵和靜電相互作用交替分布在pVIII螺旋桶末端外，并在底部收緊形成一個筆尖樣結(jié)構(gòu)。在對最后三層pVIII形成的pIII結(jié)合口袋分析表明pIII 在噬菌體衣殼組裝末期可有效地與 pVIII 競爭，從而終止基因組的包裝并幫助形成成熟的病毒粒子。
為了確定M13迷你噬菌體內(nèi)部 ssDNA 基因組的結(jié)構(gòu)，研究使用非對稱重構(gòu)方法對衣殼內(nèi)部ssDNA進行結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)ssDNA具有右手雙螺旋結(jié)構(gòu)（圖2A）。通過比較螺旋參數(shù)，M13迷你噬菌體內(nèi)部 ssDNA 基因組的螺旋結(jié)構(gòu)與A型dsDNA類似。這是研究者首次直接觀測到絲狀噬菌體環(huán)狀ssDNA結(jié)構(gòu)（圖2）。進一步分析發(fā)現(xiàn)衣殼內(nèi)表面帶正電荷殘基的非對稱構(gòu)象對于穩(wěn)定內(nèi)部ssDNA結(jié)構(gòu)起到關(guān)鍵作用。
清華大學醫(yī)學院長聘副教授，北京生物結(jié)構(gòu)前沿研究中心研究員，c7c7.app-清華大學前沿醫(yī)學研究中心研究員向燁為該論文的通訊作者，向燁課題組18級博士生賈麒為該論文的第一及唯一非通訊作者。清華醫(yī)學院已畢業(yè)的黃亮博士在冷凍電鏡數(shù)據(jù)收集方面為本研究提供了幫助。清華大學藥學院張數(shù)一教授和武漢大學殷雷教授為本研究提供了實驗材料。中國科學院生物物理所章新政研究員對非對稱重構(gòu)提供了支持。清華大學中國蛋白質(zhì)科學中心（北京分中心）提供了設(shè)施支持。該項目研究獲得c7c7.app-清華大學前沿醫(yī)學研究中心，中國科學技術(shù)部，清華大學萬科公共衛(wèi)生與健康學科發(fā)展專項基金，國家自然科學基金，清華大學春風計劃基金，北京生物結(jié)構(gòu)前沿研究中心和北京結(jié)構(gòu)生物學高精尖中心的資助。
論文鏈接：
https://www.nature.com/articles/s41467-023-41151-7
參考文獻：
1. Rakonjac, J., Bennett, N. J., Spagnuolo, J., Gagic, D. & Russel, M. Filamentous bacteriophage: biology, phage display and nanotechnology applications. Curr Issues Mol Biol 13, 51-76 (2011).
2. Sattar, S. et al. Ff-nano, short functionalized nanorods derived from Ff (f1, fd, or M13) filamentous bacteriophage. Front Microbiol 6, 316 (2015). https://doi.org:10.3389/fmicb.2015.00316
3. Rasched, I. & Oberer, E. Ff coliphages: structural and functional relationships. Microbiol Rev 50, 401-427 (1986). https://doi.org:10.1128/mr.50.4.401-427.1986
4. Specthrie, L. et al. Construction of a microphage variant of filamentous bacteriophage. J Mol Biol 228, 720-724 (1992). https://doi.org:10.1016/0022-2836(92)90858-h
5. Zhu, D. et al. Pushing the resolution limit by correcting the Ewald sphere effect in single-particle Cryo-EM reconstructions. Nat Commun 9, 1552 (2018). https://doi.org:10.1038/s41467-018-04051-9
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